Zusammenfassung

Einige ältere Zeiss Kondensoren mit numerischer Apertur (NA) von 1,4 können mittels Adaption am modernen Axio Lab.A1 oder Axiolab 5 verwendet werden. Auf diese Weise lassen sich höchstauflösende Immersion-Objektive bis zur numerischen Apertur 1,4 nutzen. Passende Kondensoren findet man bei den älteren Baureihen Zeiss Axioskop, Axioplan oder Axiophot. Hier soll die Adaption zweier älterer Zeiss Kondensoren mit Apertur 1,4 für Phasenkontrast und DIC an das moderne Axio Lab.A1 FL-LED Fluoreszenzmikroskop beschrieben werden.

Blick von hinten in den Okulartubus auf die Austrittspupille eines Objektivs, hier mit eingeschwenkter Phasenblende.

Hintergrundwissen

Die mikroskopische Auflösung im Bild hängt davon ab, wie weit Eintritts- und Austrittspupille des Objektivs zum Rand hin ausgeleuchtet werden können. Daher besteht eine Hauptaufgabe des Kondensors darin, das Objektiv so weit wie möglich bis zum Rand der Austrittspupille auszuleuchten. Kondensor und Objektiv bilden beim modernen Mikroskop mit Köhlerbeleuchtung eine justierbare, optische Einheit. Sie ist so konstruiert, dass die Blende(n) des Kondensors in die Austrittspupille des Objektivs abgebildet und die Leuchtfeldblende in die Präparateebene abgebildet werden.

Ein indirektes Maß für die mikroskopische Auflösung ist die numerische Apertur, kurz NA, eine dimensionslose Zahl. Sie ist die zweite optische Größe, welche auf Mikroskopobjektiven eingraviert ist. Je größer die numerische Apertur ist, um so höher ist das Auflösungsvermögen des Objektivs. In wässrigen Medien, entspricht die maximal mögliche NA einem Wert von etwa 1,3. Sind die betrachteten Objekte in höher brechende Medien eingebettet, kann man die NA weiter erhöhen. Zu solchen Präparaten gehört die Einbettung von Zellen in hochbrechende Einschlußmittel (z.B. Glycerol) oder in Harzen bzw. Kunstharzen eingebettete Dauerpräparate (z.B. Euparal oder Kanadbalsam). Eine Obergrenze liegt bei den meisten mikroskopischen Anwendungen in der Praxis bei NA=1,4. Generell gilt, dass der Kondensor mindestens die gleiche numerische Apertur besitzen muss, wie das Objektiv. Der Unterschied zwischen einem Trockenobjektiv, z.B. 40x/0,65 und einem Trockenobjektiv mit 63x/0,9 entspricht einem Gewinn von 50% in der Auflösung. Ein Wasser-Immersionsobjektiv 63x/1,3 bietet hingegen eine Verdopplung der mikroskopischen Auflösung gegenüber dem Objektiv mit NA=0,65. Ein Trockenkondensor 0,9 vermag ein solches Objektiv jedoch nicht vollständig auszuleuchten, so dass die maximal mögliche Auflösung nicht erreicht wird.

Immersionskondensoren in der Praxis

Für Immersions-Objektive mit einer NA>0,95 gibt es spezielle Immersions-Kondensoren (typisch: NA=1,2 ... 1,4). Diese Immersions-Objektive erfordern, dass auch der Kondensor zu immergieren ist. Das bedeutet, dass eine Immmersionsflüssigkeit zwischen der Kondensorlinse und dem Objektträger aufgebracht werden muss. Andernfalls tritt an der Glasoberfläche der Linsen beim Glas-Luft-Glas Übergang von Kondensor-Objektträger und Deckglas-Objektiv ab einem bestimmten Einfallswinkel eine Totalreflexion ein. Durch Totalreflexion gehen schiefer einfallende Lichtbündel verloren und das Objektiv mit hoher Apertur wird nicht vollständig ausgeleuchtet. Die Immersionsflüssigkeit sorgt dafür, dass man höhere Einfallswinkel des Lichts in die Glasoberflächen realisieren kann. Erst mit Immersion des Kondensors wird also die theoretisch mögliche maximale Auflösung des optischen Mikroskops erreicht. Als Immersionsflüssigkeiten kommen für Kondensor und Objektiv je nach Bauart Öl, Glyzerin oder Wasser in Frage.

Immersionsobjektive

Ein Immersions-Kondensor mit hoher Apertur ist erforderlich für Beobachtungen im Hellfeld mit Objektiven einer Apertur größer als NA=0,9. Zu diesen Objektiven zählen etwa das Plan-Neofluar 100x/1,3 (Öl), oder der Plan-Apochromat 63x/1,4 (Öl). Im Hellfeld müssen dabei sowohl das Objektiv, als auch der Kondensor mit Öl immergiert werden, damit der Kondensor die Öffnung des Objektivs vollständig ausleuchten kann.

Für die Mikroskopie von Plankton oder Zellkulturen sind moderne Wasser-Immersionsobjektive gedacht, wie das LCI Plan Neofluar 63x/1,3. Bei LCI Objektiven, die mit verschiedenen Medien verwendet werden können (Multi-Immersion), ist bei der Beobachtung von Plankton eine Immersion mit Wasser zu bevorzugen, da man mit Wasser-Immersion tiefer in die Zellen vordringen kann und hier auch eine bessere Abbildungsqualität erzielt. Weitere, rein praktische Vorteile: Wasser übt auf das Deckglas keine solchen Scherkräfte aus, wie etwa ein zähflüssiges Immersionsöl. Dennoch empfiehlt sich bei Immersion die Verwendung von Vaselinefüßchen zur Stabilisierung des Deckglases.

Es ist anzumerken, dass bei der Verwendung von Wasser-Immersionsobjektiven auch die Immersion des Kondensors mit destilliertem Wasser möglich ist. Ein großer Tropfen genügt. Es ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind. Die Verwendung von Wasser als Immersionsmedium vereinfacht bei dieser Anwendung auch die anschließende Reinigung von Kondensor und Objektiv.

Kompatible Kondensoren

Die Adaption der nachstehend gelisteten Kondensoren muss zwei Probleme lösen: (1) Die Anpassung des Durchmessers der Ringschwalbe und (2) der Ausgleich der Höhendifferenz für die älteren Kondensoren. Von Zeiss gab es einen passenden Adapter mit der Zeiss-Nr. 445462 für die Verwendung der älteren Kondensoren des frühen Axioskop (Unendlich), der eine Adaption dieser Kondensoren an die neueren Stative der Serien des AxioLab oder AxioScope ermöglicht.

Folgende Kondensoren 1,4 der früheren Axio Serien wurden bereits erfolgreich am Axio Lab.A1 adaptiert:

• Zeiss 445248, Kondensor NA=1,4, HF/Ph/DIC, Arbeitshöhe 38 mm (Axioskop)
• Zeiss 445249, Kondensor NA=1,4, HF/Ph/DIC

Ein kleiner Restbestand der originalen Zeiss Adapter ist noch verfügbar und kann bei mir erworben werden.

Ältere Kondensoren 1,4 der Zeiss Standard Endlich-Serien können nicht adaptiert werden. Sie sind optisch nicht kompatibel mit modernen Unendlich-Objektiven und leuchten die hohe Apertur nicht vollständig aus. Daher bleibt diese Kombination optisch wirkungslos.

Stentor coeruleus

Der Ciliat Stentor coeruleus in hoher Vergrößerung mit Zeiss LCI Plan Neofluar 63/1,3 (DIC) und einem Kondensor 1,4 bei schiefer Beleuchtung. Objektiv und Kondensor wurden mit einem Tropfen destilliertem Wasser immergiert. Nun leuchtet der Kondensor 1,4 das Objektiv homogen aus. Zellkerne, Macronucleus (Ma) und Micronucleus (Mi) sowie gefärbte Granula des Wimpertiers erscheinen in sehr hoher Auflösung und mit vielen Details. Man blickt hier mit dem Objektiv durch die dunkel gefärbte Granula des Ciliaten hindurch in die Zellmitte. Die Abbildungsqualität in einer Schichttiefe von mehr als 100 µm ist enorm. Das LCI Plan-Neofluar bildet problemlos die Kernstruktur mit der die DNA umgebenden Kernmembran in einem "optischen Schnitt" ab. Am oberen Bildrand sieht man die unter der Pellicula liegende, gefärbte Granula (1 und 2), durch die das Objektiv hier hindurch schaut. Die oberste Schicht enthält blau gefärbte Stentorine, die als Giftstoffe der Abwehr von Freßfeinden dient. Darunter eine weitere Schicht, die sich aus weiteren Organellen, auch Mitochondrien zusammen setzt.

Fazit

Die Adaption eines passenden Kondensor 1,4 früherer Baureihen an das Axio Lab.A1 und Axiolab 5 erschließt die Möglichkeit moderne Hochleistungsoptiken ohne Abstriche zu verwenden. Der Aufwand ist vergleichsweise gering. Dabei profitiert man von dem Umstand, dass die modernen Stative mit deutlich leistungsfähigeren LED-Beleuchtungen und Auflicht-Fluoreszenzeinrichtungen aufwarten. So wird aus dem "kleinen" Axiolab im Handumdrehen ein High-End Mikroskop ohne Abstriche für den ambitionierten Amateur oder den wissenschaftlichen Routineeinsatz.