Zusammenfassung

Beschrieben werden Maßnahmen, um die Bildqualität von Wasserproben unter dem Mikroskop zu optimieren.

Vorgeschichte

Die meisten Beobachter von planktonischen Lebewesen unter den Mikroskopikern kennen sicherlich den Effekt: Die visuelle Beobachtung, und erst recht die fotografische Abbildung von im Wasser lebenden Organismen mit dem Lichtmikroskop will an manchen Tagen einfach nicht gelingen. Mit einiger Erfahrung stellt sich die Erkenntnis ein, dass der Effekt mit der Schichtdicke der Wassersäule über den beobachteten Organismen zusammen hängt. Dieser Effekt hatte auch mich Jahre lang beschäftigt und ich habe scherzhaft immer gesagt, dass mein Mikroskop launisch sei und oft auch schlechte Tage habe.

Beobachter von Plankton ("Tümpler") haben es meist mit dicken Schichten einer Wassersäule im Präparat zu tun. Oft hat man wieder einmal eine zu große Menge Wasser unter dem Deckglas eingeschlossen. Auch die Objekte selbst sind gelegentlich recht dick, etwa große Ciliaten, Kleinkrebse oder größere Zieralgen. Manche Beobachtungsverfahren, etwa die Mikroaquarien von Michael Müller setzen sogar voraus, dass man vergleichsweise dicke Wasserschichten erhält, um das Leben im Wassertropfen zu beobachten.

Link: Mikroaquarien von Michael Müller

Unter diesen Umständen liefern Standardobjektive ein gutes Bild nahe dem Deckglas liegender Objekte, die Abbildung leidet jedoch spürbar, je tiefer man in die wässrige Probe eindringen will. Die klassischen Objektive am aufrechten Mikroskop sind Trockenobjektive (bis etwa 40x) oder Ölimmersionen (60x-100x). Die mittleren Vergrößerungen funktionieren meist noch zuverlässig auch in dicken Wasserschichten (bis etwa 20x). Schon bei einer Vergrößerung 40x erkennt man jedoch Unterschiede in der Abbildung in verschiedener Wassertiefe im Präparat. Der Effekt ist besonders störend, wenn man ein besseres, gut farbkorrigiertes Objektiv verwendet, etwa Fluare, Neofluare oder Apochromate. In tiefen Wasserschichten gelangen solche Objektive rasch an ihre Leistungsgrenze. Je tiefer man in die Probe fokussiert, um so flauer erscheint die Abbildung. Farbe, Kontrast und Bildschärfe verwaschen mit zunehmender Tiefe in der Probe. In gewisser Weise lässt sich die genaue Fokuslage nicht mehr gut bestimmen, wichtige Bestimmungsmerkmale werden nicht mehr gesehen.

Physikalischer Hintergrund

Beim Übergang vom Objektiv durch Luft oder ein Immersionsmedium über das Deckglas bis zum Objekt durchlaufen die Lichtstrahlen abwechselnd Luft, Glas und Wasser, eventuell noch eine rauhe Pellicula der betrachteten Lebewesen. An jedem dieser Übergänge werden die Lichtstrahlen gebrochen und abgelenkt. Der optische Fehler, der hierbei auftritt, heißt sphärische Aberration. Hierbei bilden Lichtbündel, die das Objektiv am Rand durchlaufen und Lichtbündel nahe der optischen Achse unterschiedliche Fokusebenen. Grund sind die Wechsel der Brechungsindizes an den Grenzflächen (Glas-Luft, Glas-Medium, Glas-Wasser).

Die Auflösung der Objektive hängt von einer physikalischen Größe ab, der numerischen Apertur. Sie ist bei Objektiven als zweite Zahl neben der Vergrößerung aufgedruckt. Bei Trockenobjektiven ist mit einer numerischen Apertur (NA) von 0,95 eine praktische Grenze erreicht, während die NA für Öl-Immersionsobjektive meist mit Werten von 1,3-1,4 angegeben ist. Damit ist die Auflösung von Immersionsoptiken höher, als die eines Trockenobjektivs. Noch höhere Aperturen lassen sich nur für Spezialanwendungen und mit höher brechenden, sehr speziellen Immersions- und Einschlussmedien erzielen (siehe weiter unten). Spezielle Immersionsobjektive mit NA um 1,5 waren bereits um 1892 bekannt (siehe auch: S. Bradbury, Evolution of the Microscope. Elsevier, 2014).

Abb.: Entstehung der sphärischen Aberration beim Öl-Immersionsobjektiv bei Beobachtung in wässrigen Medium. Abbildung entnommen aus: Vermeulen, K. et al. 2006.

Grund für einen Abbildungsfehler dieser Art ist nicht die Unzulänglichkeit der Objektive sondern das Verhalten des Lichts beim Übergang zweier Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex. Insbesondere die besonders gut farbkorrigierten Optiken, etwa Apochromate, sind für eine bestimmte Deckglasdicke (Standard: 0,17 mm) gerechnet und liefern eine gute Abbildung nur in einer vergleichsweise dünnen Schicht knapp unterhalb des Deckglases. In tieferen Schichten einer Wasserprobe werden die Lichtstrahlen anders gebrochen. Daher sind Öl-Immersionsoptiken hier ebenfalls empfindlich. Immersionsmedium und Deckglas besitzen einen anderen Brechungsindex, als eine dicke Wasserschicht. Zudem verändert sich beim Fokussieren deren Dicke relativ zueinander. Die Lichtstrahlen laufen mit zunehmender Tiefe im Präparat immer mehr auseinander und divergieren auch für unterschiedliche Lichtfarben. Der beobachtete Effekt heißt sphärische Aberration. Mit zunehmender Tiefe führt er zu einem zunehmenden Kontrastverlust der Abbildung, da Lichtstrahlen außerhalb der optischen Achse unterschiedliche Fokusebenen besitzen. Nicht zuletzt nimmt auch die chromatische Aberration zu (Farbfehler).

Strategien zur Vermeidung sphärischer Aberration

Bis hierher haben wir den Effekt und seine Ursache beschrieben. Hieraus ergeben sich natürlich mögliche Gegenmaßnahmen. Um diesen Effekt zu mildern, gibt es mindestens die folgenden Strategien für kleinen, mittleren und großen Geldbeutel.

1. Abblenden
2. Quetschpräparation
3. Wahl dünner Deckgläser
4. Präzise Probenvolumina
5. Hochbrechende Einschlussmedien
6. Das inverse Mikroskop
7. Wasser-Immersionsobjektive

Sie sollen im folgenden im Detail beschrieben werden.

Abblenden

In der älteren Fachliteratur und auch in älteren mikroskopischen Anleitungen wird gelegentlich empfohlen das Objektiv abzublenden. Diese Maßnahme kostet nichts. Tatsächlich scheint Abblenden mit dem Kondensor den visuellen Bildeindruck in gewisser Weise zu steigern. Der positive Effekt beruht darauf, dass randliche Lichtbündel ausgeblendet werden und so die sphärische Aberration etwas vermindert wird. Ab einer gewissen Wassertiefe im Präparat wird diese Maßnahme die spärische Aberration nicht mehr beseitigen können. Ein wesentlicher Nachteil dieser Maßnahme besteht darin, dass die Abbildungsleistung guter Objektive verringert wird, da durch Reduktion der Apertur das optische Auflösungsvermögen des Objektivs vermindert wird. Feine Details werden dabei nicht besser dargestellt, sondern verschwinden mitunter. Es muss leider gesagt werden: Auch wenn der Effekt von weniger erfahrenen Beobachtern visuell anders bewertet werden mag, verbessert Abblenden die Bildqualität nicht, das Gegenteil ist der Fall. Insbesondere für die Mikrofotografie ist Abblenden nicht zu empfehlen.

Quetschpräparation

Sofern es die beobachteten Organismen zulassen, ist eine Quetschpräparation empfohlen, um zu besseren fotografischen Abbildungen zu gelangen. Der Effekt hängt auch hier damit zusammen, dass Trockenobjektive und Ölimmersionen nicht für die Beobachtung in tieferen Schichten geeignet sind (aus genannten Gründen). Quetsch-Präparation hilft sphärische Aberration zu reduzieren indem die Schichtdicke vermindert wird und das Objekt näher an das Deckglas gesetzt wird. Bei Trockenobjektiven nutzt man hierbei die Verdunstung des Wassers aus. Beim Öl-Immersionsobjektiv ist die Angelegenheit komplizierter: Durch das Immersionsöl wird das Deckglas zwischen Objektiv und Objekt bewegt. Auch bei der Ölimmersion tritt sphärische Aberration auf, da nun der Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit höher ist, als der Brechungsindex des Wassers. Daher bleibt auch beim Öl-Immersionsobjektiv die Bildqualität schwer zu steuern. Ein seriöser Vergleich verschiedener Trockenobjektive und Öl-Immersionsobjektive unter solchen Umständen ist nicht möglich. Nachteilig ist, dass sich nicht alle Organismen beliebig flach quetschen lassen, ohne sie zu zerstören.

Wahl dünner Deckgläser

Billige Deckgläser aus dem Handel haben meist eine Dicke von nur 0,13-0,16 mm und entsprechen nicht dem Standard für den hochwertige Objektive gerechnet sind (Deckglasdicke: 0,17 mm). Da man jedoch eine Refraktion der Wassersäule ausgleichen will, kann man versuchen mit einem dünneren Deckglas tiefer in das Präparat vorzudringen. Da ich selbst nur die Normdeckgläser (0,17 mm) verwende, ist mir dieser Effekt immer wieder aufgefallen, wenn ich durch Mikroskope von Kollegen gesehen habe. Die Abbildungen in Wasserproben mit einfach ausgestatteten Mikroskopen kann von der Wahl dünnerer Deckgläser profitieren und auch etwas kontrastreichere Bilder liefern. Die Methode hat den Nachteil, dass die volle Leistung gut farbkorrigierter Objektive nicht ausgeschöpft wird, da Objektive für andere Dicken der Deckgläser konstruiert sind. Diese Methode sollte für den Allgemeingebrauch näher untersucht werden. 

Präzise Probenvolumina

Ich arbeite immer mit einstellbaren Mikroliterpipetten, um einheitliche Wassermengen zu entnehmen und so möglichst reproduzierbare Präparate und Abbildungen zu erhalten. Solche Pipetten kosten ein gewisses Geld, die austauschbaren Pipettenspitzen ebenfalls, aber es lohnt sich. Die Tropfengröße ist an der Pipette auf 25 µl oder 50 µl Volumen eingestellt, je nachdem ob kleine bis mittlere Ciliaten oder die großen Brummer schadlos beobachtet werden sollen. Diese Maßnahme mag gegenüber Schilderungen anderer Mikroskopiker, die immer reichlich Probenvolumen beschreiben, besonders penibel und überflüssig erscheinen. Es hat jedoch rein praktische Gründe. Mit einem Deckglas von 18x18 mm ergibt ein Probenvolumen von 25 µl eine Wassersäule von etwa 75 µm Höhe. Dementsprechend hat man von Beginn an eine geringere Wassersäule. Anfänglich ist diese Höhe noch komfortabel für die meisten Ciliaten, doch die Dauer bis zur Quetschung der Einzeller verkürzt sich. Während der Beobachtung nimmt das Probenvolumen durch Verdunstung stetig ab. So kann man zeitlich steuern, wann die zu untersuchenden Mikroorganismen der Reihe nach abgelichtet werden. Die großen Ciliaten zuerst, die kleinen am Schluss. Ggf. wird mit einer Mikroliterpipette Wasser in 5 µl Schritten nach gegeben, um der Verdunstung entgegen zu wirken und die Beobachtungszeit zu verlängern. Da ich meist mit Fluoreszenz arbeite, muss das Verhältnis Fluorochrom zu Probenvolumen auch weitgehend konstant sein, um reproduzierbare Färbungen zu erhalten. So sind durch penibles Einhalten bestimmter Probenvolumina zwei Fliegen mit einer Klappe geschlagen.

Hochbrechende Einschlussmedien

In der wissenschaftlichen Fachliteratur ist gelegentlich der Hinweis gegeben, dass die Beobachtung von Frischpräparaten oder Zellkulturen mit hochbrechenden Medien geschieht. Immersionsobjektive setzen voraus, dass man durch ein Medium gleicher Brechzahl blickt, wie Glas. Dabei spielt es jedoch keine Rolle, ob es sich um Deckgläser, Immersionsöl oder Einschlussmittel handelt. Öl-Immersionsobjektive sind gedacht für die Betrachtung von Dauerpräparaten in hoch brechenden Harzen und Kunstharzen (Euparal, Kanadabalsam, etc.). So lässt sich die sphärische Aberration bei der Verwendung hochauflösender Immersionsoptiken mit Frischpräparaten durch hochbrechende Einschlußmedien, wie Glyzerin oder spezielle Öle verringern. Die Zellen oder Zellkulturen werden hierfür gewaschen und mit dem hochbrechenden Medium überschichtet. Nachteilig bei dieser Methode ist, dass die Präparation aufwendig ist und für freilebende Protozoen sicherlich nicht gut funktioniert. Generell ist die Verwendung hochbrechender Medien nur in Verbindung mit hoch vergrößernden Öl-Immersionsoptiken vorteilhaft.

Das inverse Mikroskop

Im Grunde hat dieser Typ des Mikroskops zum Ziel Organismen oder Zellkulturen zu beobachten, die sich typischerweise auf dem Boden des Präparats aufhalten oder hierauf gezüchtet werden. Beim inversen Mikroskop blickt man daher von unten in die Probe, um den Blick durch dicke Wassersäulen zu umgehen. Wir erinnern uns, dass das Thema hier die Vermeidung von sphärischer Aberration zum Ziel hat. Spezielle Objektive für das inverse Mikroskop sind für die Benutzung dicker Objektträger oder Kulturgefäße gerechnet. Auch hier ist das Ziel die sphärische Aberration zu verringern. Die Anschaffung eines solchen Mikroskops hat in der Regel den Nachteil, dass das inverse Mikroskop nur begrenzt ausbaufähig ist und die Bildqualität spezielle Objektive für dicke Glasträger und Kulturgefäße erfordert. Deren Leistung bleibt hinter der Leistung speziell optimierter Objektive meist zurück. Alternativ kann man Objektive für Deckgläser mit Normdicke 0,17 mm verwenden mit speziellen Präparatehaltern für Gläser entspechend geringer Dicke verwenden. Die sicherlich beste Option, wie auch beim aufrechten Mikroskop, ist die Verwendung von Wasser-Immersionsobjektiven, wie sie im Folgenden beschrieben werden. Denn auch das inverse Mikroskop leidet, wenn man gewöhnliche Trockenobjektive einsetzt, ebenfalls unter spärischer Aberration. Daher kommen in speziellen Bereichen, in denen hohe Abbildungsleistung gefordert ist, ebenfalls Wasserimmersions- oder Multi-Immersionsobjektive zum Einsatz, etwa bei der Konfokalmikroskopie oder anderen Super-Resolution Verfahren.

Wasser-Immersionsobjektive

Wasser-Immersionsobjektive unterscheiden sich von Trockenobjektiven oder Öl-Immersionsobjektiven dadurch, dass sie speziell für die Beobachtung in wässrigen Lösungen optimiert sind. Sie sind je nach Bauform für eine Benutzung mit oder ohne Deckglas (Eintauchobjektive) gerechnet. Bei Objektiven, die für die Benutzung von Deckgläsern gerechnet sind wird ein Wassertropfen als Immersionsmedium zwischen Objektiv und Deckglas eingebracht. Durch diese baulichen Maßnahmen erreicht man, dass die Lichtstrahlen, weitgehend unabhängig von der Tiefe des Objekts in der wässrigen Lösung, nahezu ungestört durch Wasser laufen. Der optische Weg zum beobachteten Objekt bleibt dabei konstant. Verwendet man Wasser-Immersionsobjektive, die die Benutzung eines Deckglases erfordern, variiert lediglich die Lage des Deckglases zwischen dem betrachteten Objekt und dem Objektiv. Ferner ist der Totalreflexionswinkel beim Grenzübergang Wasser-Glas ein anderer als bei Luft-Glas. Daher lassen sich größere Licht-Einfallswinkel realisieren und damit auch eine höhere numerische Apertur gegenüber Trockenobjektiven.

Hieraus ergeben sich für Wasser-Immersionsobjektive eine Menge Vorteile gegenüber den Trockenobjektiven oder Öl-Immersion. Zum einen lässt sich die spärische Aberration kompensieren, zum anderen erreicht man gegenüber Trockenobjektiven eine deutlich höhere Auflösung und Bildschärfe. Wasser- oder Multi-Immersionsobjektive können bei Immersion mit Wasser eine numerische Apertur um 1,2-1,3 realisieren. Gegenüber einem Standardobjektiv 40x/0,6 erreicht ein LCI Plan-Neofluar 63x/1,3 nahezu die doppelte Auflösung. Soll eine numerische Apertur von mehr als 0,9 mit einem Wasser-Immersionsobjektiv erreicht werden, muss übrigens auch der Durchlicht-Kondensor hierfür ausgelegt sein und immergiert werden.

Das Prinzip der Wasser-Immersion mit Korrekturring wurde von Hartnack eingeführt. Charles Darwin hatte von seinen Objektiven bereits 1847 erfahren und sie in einem Brief an seinen Sohn lobend erwähnt. Hartnack stellte sie 1867 auf einer Pariser Ausstellung aus, wo sie als bestes Objektiv der damaligen Zeit prämiert wurden. Später wurden Wasser-Immersionsobjektive auch von anderen Herstellern eingeführt. Objektive für Öl-Immersion zur Erhöhung der Apertur wurden erst wenige Jahre später für einen anderen Zweck eingeführt. So kompensieren Ölimmersionen bei der Beobachtung in Harz eingebetteter (Dauer-) Präparate auftretende sphärische Aberration der Trockenobjektive. Man verwendet hier Öle, die dem Brechungsindex der Harze gleich kommen, um die spärische Aberration der Lichtstrahlen im Einbettungsmedium (Harz) zu kompensieren. Vor diesem historischen Hintergrund erscheint es kurios an, dass in der Fachliteratur bis heute Öl-Immersionsobjektive für die Beobachtung planktonischer Lebensformen empfohlen werden.  Eine sicherlich schlechte Empfehlung, die von den Autoren seit mehr als einem Jahrhundert unreflektiert abgeschrieben wurde und wird.

Zweifellos sind moderne Wasser- oder Multi-Immersionsobjektive auf vielfache Weise weiterentwickelt, neu konstruiert und verbessert worden. Die Grenze der numerischen Apertur liegt hier um NA=1,3, was dem Beobachtungsmedium Wasser bzw. der Totalreflexion an den Übergängen Wasser-Glas geschuldet ist. Aktuelle Wasser- oder Multi-Immersionsobjektive besitzen eine Möglichkeit zur Korrektur der Dicke des Deckglases. Die Dicke des Deckglases sollte man ggf. mit einer Messlehre nachmessen und den Korrektionsring entsprechend einstellen. Moderne Spezialobjektive wie die Life-Cell-Imaging (LCI) Objektive oder C-Apochromate von Zeiss sind noch empfindlicher einstellbar und besitzen zusätzlich eine Kompensation der Temperatur von Probe und Objektiv (meist im Bereich von 23-37°C). Zweifellos liefern diese empfindlichen Spezial-Optiken den besten Kontrast bei Wasserproben, für die sie bestimmt sind. Solche Objektive sind sicherlich auch eine teuere Wahl bei der Anschaffung. Meine Empfehlung fällt jedoch eindeutig zugunsten dieser Spezialobjektive aus, da sie bei Beobachtung in wässrigen Medien den besten Kontrast und höchste Auflösung liefern.

Abb.: Der Einstellring an einem älteren Zeiss Multi-Immersionsobjektiv 40x/0,9 gestattet die Verwendung verschiedener Immersionsmedien: Öl, Glyzerin und Wasser. Für wässrige Proben ist die Immersion mit einem Wassertropfen erforderlich. Diese ältere Objektiv-Serie ist nicht mehr erhältlich. Sie liefert nicht so perfekte Resultate wie moderne modernen LCI Plan-Neofluare und C-Apochromate (W), deren etwas einfacher konzipierter Vorläufer sie ist.

Ich möchte hier nur zwei Vergleichsaufnahmen zeigen, die sphärische Aberration bei einem sehr guten Trockenobjektiv Plan-Neofluar 40x/0,75 demonstrieren. Zum Vergleich eine Aufnahme durch ein Wasser-Immersionsobjektiv vergleichbarer Vergrößerung, ein C-Apochromat 40x/1,2 W Corr. Man blickt hier durch eine Wassersäule von etwa 150 µm Höhe auf eine am Boden des Präparats liegende Grünalge.

Abb: Eine Grünalge in dicker Wassersäule (150 µm) am Boden des Präparats auf dem Objektträger liegend. Die beiden RAW Aufnahmen wurden jeweils einzeln fokussiert und nicht digital bearbeitet. Links: Abbildung mit dem Trockenobjektiv Zeiss Plan-Neofluar 40x/0,75: Rechts: Abbildung mit dem modernen Wasser-Immersionsobjektiv Zeiss C-Apochromat 40x/1,2 W. Das Trockenobjektiv zeigt bei dieser Wassersäule deutliche sphärische Aberration, die Fokuslage ist nicht mehr definiert und es treten chromatische Fehler und die Bildung von Schatten auf. Das Wasser-Immersionsobjektiv liefert unter gleichen Bedingungen eine saubere und gestochen scharfe Abbildung.

Fazit

Der Vergleich optischer Abbildungen oder Fotografien mit dem Mikroskop hängt von sehr vielen Faktoren ab. Sphärische und chromatische Aberration tritt ein, wenn Trockenobjektive oder Öl-Immersionsobjektive tiefer in wässrige Lösungen vordringen sollen. Daher sind solche Objektive praktisch nicht geeignet für die Beobachtung in tieferen Wasserschichten und auch nicht untereinander vergleichbar. Bereits die Wahl unterschiedlich dicker Deckgläser oder eine veränderte Schichtdicke der Wasserprobe können zu eklatanten Unterschieden in der Qualität der optischen Abbildung führen. Die Wahl dünnerer Deckgläser kann ein Notbehelf bei einfachen Trockenobjektiven sein. Sicherlich trägt eine gute Probenvorbereitung und die Wahl genau eingehaltener Probenvolumen einen wesentlichen Teil zum Gelingen guter fotografischer Resultate bei. Moderne Wasser-Immersionsobjektive sind für diese wechselnden Bedingungen konzipiert worden und die beste Wahl für die Beobachtung lebender Zellen in wässrigem Medium. Sie liefern konstante Abbildungsqualität unabhängig von der Schichtdicke im wässrigen Medium. Wasserimmersions-Objektive sollten dann eingesetzt werden, wenn eine gleichbleibend optimale Abbildungsqualität hinsichtlich Kontrast und optischer Auflösung gefordert ist.

Literatur

Vermeulen, K. et al., 2006. Optical trap stiffness in the presence and absence of spherical aberrations. Applied Optics 45(8):1812-9.

S. Bradbury, 2014. Evolution of the Microscope. Elsevier.

Zeiss Operating Manual: Use of the C-Apochromat 40x/1,2 W Corr, Datum unbekannt.