Zusammenfassung
Im Vorgriff auf eine bald erscheinende Publikation von mir, möchte ich heute die wichtigen Schritte und Bearbeitungsschritte der optimalen Einstellung der schiefen Beleuchtung vorstellen. Die schiefe Beleuchtung ist das älteste bekannte Interferenzkontrastverfahren in der Mikroskopie. Auf die wichtige theoretische Erklärung der schiefen Beleuchtung möchte ich hier nicht näher eingehen, sondern auf meinen bald erscheinenden Artikel verweisen.
Optimale Einstellung der schiefen Beleuchtung
Moderne Mikroskope der gehobenen Klasse verfügen heute meist über einen Kondensor mit einer meist drehbaren Blendeneinrichtung, um Hellfeld, Phasenkontrast und Dunkelfeld einzustellen. Solche Kondensoren lassen sich vorteilhaft verwenden, um eine schiefe Beleuchtung einzustellen. Man wählt ein Objektiv geringer vergrößerung, z.B. das Objektiv 10x. Nun stellt man die Blendeneinrichtung des Kondensors auf die Einstellung Hellfeld. Anschließend zieht man ein Okular heraus und blickt in den Tubus. Nun wird die Hellfeld-Blende soweit aus ihrer Einrastposition herausgedreht, dass ihr Rand exakt in der Mitte der Austrittsöffnung des Objektivs liegt. Man sollte die Hellfeldblende nicht zu weit und nicht zu wenig aus der Einrastposition herausdrehen, sondern genau so, dass die Austrittsöffnung des Objektivs so erscheint, wie in der folgenden Abbildung dargestellt.
Der Trick der perfekten schiefen Beleuchtung: Welche Blende auch immer man für die schiefe Beleuchtung verwendet, sie soll nur von der Mitte der Austrittspupille des Objektivs ausgehend bis zum Rand die Apertur des Objektivs beleuchten.
Abbildung 1: Ei eines Bauchhärlings aufgenommen in schiefer Beleuchtung. In der oberen Reihe dargestellt ist die Justage der dezentrierten Hellfeldblende. In der mittleren Reihe dargestellt, die erhaltenen Digitalaufnahmen. In der unteren Reihe digital bearbeitete Ergebnisse mit gleichem Kontrast. Wie man erkennt, liefert die mittlere Einstellung optimale Ergebnisse. Störende Aufhellungen oder Schatten verschwinden in dieser Einstellung gegenüber den beiden sub-optimalen Einstellungen (links, rechts).
Bearbeitung von Fotografien mit dem Computer
Viele weitere Bilder auf dieser Website wurden von mir mit dieser Methode der "perfekten schiefen Beleuchtung" gewonnen, bei der der Kondensor optimal eingestellt ist. Die nachträgliche Bildbearbeitung wurde dabei nach einer Standardmethode digital entwickelt. Für die letztlich gewählte Methode der digitalen Optimierung des Bildkontrasts ist zu unterscheiden, ob man gefärbte Objekte oder transparente Objekte vor sich hat.
Digitale Fotografien werden von der Kamera häufig mit einer nicht-linearen Kennlinie, der sogenannten Gamma-Kurve korrigiert. Dies führt dazu, dass Bilder oft heller erscheinen, als es für eine gute Wiedergabe von feinen Details förderlich wäre. Mit einem geeigneten Bildbearbeitungsprogramm kann man dies korrigieren, indem man die Kennlinie "nach unten durchhängend" korrigiert, um so den Effekt einer nach oben gebogenen Gamma-Kurve zurück zu nehmen. Diese Maßnahme kann den Kontrast von Aufnahmen sehr transparenter Objekte in schiefer Beleuchtung bereits sehr gut fördern.
Die folgende Anleitung empfiehlt sich nur für sehr transparente Objekte. Bei Objekten mit einer gewissen Grundfärbung führt die hier vorgestellte Methode zu keinen guten Ergebnissen.
Typischerweise erscheinen sehr transparente Organismen oder Zellen in der schiefen Beleuchtung, wie in der Abbildung links zu sehen, trotz Einstellung der optimalen schiefen Beleuchtung auf digitalen Fotografien noch recht flau. Ein Grund ist die erwähnte, nicht-lineare Gammakennlinie der darstellenden Bildprogramme, gleich ob die Bilder "raw" oder als JPEG abgelegt werden. Im Gegensatz zum Hellfeld sind schon wesentlich mehr feine Details erkennbar. Doch lässt sich hier noch einiges verbessern. Mit dem Bildbearbeitungsprogramm der Wahl kann man nun versuchen, den Kontrast so einzustellen, dass man schrittweise die dunklen Bildbereiche dunkler erscheinen lässt. Hier dargestellt ist beispielsweise ein Wimpertier der Gattung Colpidium. Von links nach rechts wird der Untergrund "angehoben" bis der Hintergrund in einem mittleren Grau erscheint und die dunkleren Stellen im Bild dunkelgrau erscheinen. Nun erscheint das Wimpertier mit sehr gutem Kontrast dargestellt und die Wimpern und selbst das "Gebiss" der Mundöffnung (die undulierende Membran) wesentlich deutlicher erkennbar.
Abbildung 2: Wimpertier der Gattung Colpidium aufgenommen in schiefer Beleuchtung mit verschiedener digitaler Nachbearbeitung. Links: Unbearbeitete RAW Aufnahme nach der Transformation der Kameradaten mit Gamma-Kennlinie. In dieser Darstellung ergeben nahe beieinander liegende, ähnlich helle Farbtöne ein sehr kontrastarmes Bild. Mitte: Bearbeitete Aufnahme nach Rücknahme der Gammakurve (Linearisierung) und geringer Anhebung des Schwarzwerts. Rechts: Ein stärker angehobener Schwarzwert ist nur bei sehr transparenten Objekten möglich und führt zu einer Verstärkung des Kontrasts.
Literatur
Bauer, T. Die perfekte schiefe Beleuchtung. Mikroskopie 4/2020. Dustri Verlag.